กุ้งเครย์ฟิช ที่บ้านป่วยตายเป็นจำนวนมากๆ โดยสังเกตว่าก่อนตาย กุ้งมีสีที่แปลกไป และ กล้ามเนื้อมีสีขาวขุ่น เกิดจากสาเหตุอะไรได้บ้าง ?

กุ้งเครย์ฟิช ที่บ้านป่วยตายเป็นจำนวนมากๆ โดยสังเกตว่าก่อนตาย กุ้งมีสีที่แปลกไป และ กล้ามเนื้อมีสีขาวขุ่น เกิดจากสาเหตุอะไรได้บ้าง ?

กุ้งเครย์ฟิชนั้น บางครั้งเราจะพบว่า มีอาการป่วย และ ตายในเวลาไม่นานนัก โดยที่ถ้าสังเกตจากภายนอกนั้นจะพบว่า กุ้งนั้นมีลักษณะตัวเป็นสีส้ม และเนื้อที่ส่วนหน้าท้องนั้น มีสีขาวขุ่น ซึ่งสาเหตุนั้น ก็สามารถเป็นได้จากทั้ง ในส่วนของปัญหา ไวรัส และ แบคทีเรีย ครับ

ปัญหาในส่วนของไวรัสนั้น อาจจะเกิดจาก ไวรัส ตัวแดงดวงขาว หรือ White spot syndrome virus หรือมีชื่อย่อว่า WSSV โดยกุ้งสามารถติดเชื้อได้จากหลากหลายสาเหตุ เช่น จากการกินอาหาร , การปนเปื้อนเชื้อไวรัสจากน้ำและ การมีกุ้งที่เป็นพาหะ เลี้ยงอยู่ในระบบด้วย โดย ความรุนแรง และ อัตราการแพร่ระบาดของโรค จะพบในน้ำที่มีความเค็มสูง มากกว่าความเค็มต่ำ นั่นคือ สามารถพบโรคนี้ได้ ทั้งในกุ้งน้ำจืด และ กุ้งทะเลนั่นเอง เพียงแต่ กุ้งน้ำจืด เช่น พวกกุ้งฝอยต่างๆ ก็สามารถเป็นโรคนี้ได้เช่นกันครับ รวมทั้งค่าอุณหภูมิด้วย ถ้าเป็นช่วงที่มีอุณหภูมิสูง จะพบการระบาดของโรคนี้ได้ต่ำกว่า ดังนั้น จึงมักพบการระบาดของไวรัสชนิดนี้ได้มาก ในช่วงปลายปี - ต้นปี ของทุกๆปีเป็นต้น

เชื่้อไวรัส ตัวแดง ดวงขาวนั้น สามารถก่อให้เกิดโรค และ เป็นพาหะของโรค ในสัตว์ได้หลากหลายชนิด มากกว่า 50 สปีชียส์ เช่น ปู,กุ้งน้ำจืด,กุ้งมังกร และ ยังพบในสัตว์พาหะอีกบางอย่าง ที่เป็นอาหารของกุ้ง ด้วย เช่น อาร์ทีเมีย และ ครัสเตเชียลเล็กๆ อื่นๆ สำหรับการระบาดของโรคไวรัส ในชนิดนี้ นั้นมักพบได้มาก ในการเลี้ยง กุ้งเครย์ฟิช บางชนิด เช่น กุ้งก้ามแดง หรือ กุ้งก้ามหนาม สาย P.clarkii ในรูปแบบการผลิตกุ้งเนื้อ คือมีการเลี้ยงรวมกัน ในที่ๆความเค็มไม่สูงมากนั่นเอง และ เมื่อมีการจับกุ้งเครย์ฟิช ที่เลี้ยงรวมกับ กุ้งขาว แวนนาไมขึ้นมา จึงมีการค้นพบว่า ในบางแหล่ง ก็พบการติดเชื้อ และ การเป็นพาหะ ซึ่งกันและกัน ของกุ้งทั้งสองประเภทนี้ครับ และ เนื่องจากเป็นโรคที่มีสาเหตุมาจากไวรัส จึงไม่มียารักษาใดๆ และ กุ้งจะตายในเวลาที่ค่อนข้างรวดเร็วมาก ภายใน 1 - 2 วัน หรือ ตัวที่รอด ก็จะอยู่ในสภาพที่เป็นพาหะต่อไป

การป้องกัน โรคไวรัส ตัวแดง - ดวงขาว

- มีการพักน้ำ ก่อนนำน้ำมาใช้ในฟาร์มเลี้ยงกุ้ง

- ก่อนจะนำกุ้งเครย์ฟิช จากแหล่งใหม่ๆ เข้ามา ขอให้ทำการกัก และดูอาการของโรค ก่อน อย่างน้อยประมาณ 7 - 10 วัน

- ไม่เลี้ยงกุ้งให้หนาแน่นเกินไป

- ดูแลคุณภาพน้ำ เพื่อให้กุ้งนั้นมีความแข็งแรง

- หลีกเลี่ยงการเลี้ยงกุ้งด้วยอาหารสด เช่น กุ้งฝอยดิบ , กุ้งฝอยทะเล , คริลล์ , เนื้อปูทะเล , หอยทะเล หรือ เพรียงทรายสดๆ จากธรรมชาติ

- ใช้สารกระตุ้นภูมิคุ้มกัน เพื่อช่วยเพิ่มเปอร์เซ็นต์ ความแข็งแรงของกุ้ง เช่น เบต้า กลูแคน , วิตามินซี , ฟูคอนแดน ( สารสกัดจากสาหร่าย )

- ก่อนลงกุ้งล็อตใหม่ อาจจะแช่บ่อ และ อุปกรณ์ เลี้ยงกุ้งต่างๆ ด้วยคลอรีน ประมาณ 30 PPM นานประมาณ 2 สัปดาห์ หรือ แช่อุปกรณ์เลี้ยงกุ้ง ในน้ำร้อน 70 องศา หรือมากกว่า นาน 15 - 20 นาที

- มีการบำบัดน้ำ ให้สะอาด ก่อนปล่อยน้ำทิ้งลงสู่ธรรมชาติ

และ ปัญหาที่เกี่ยวกับเรื่องของ แบคทีเรีย ตัวร้าย ที่จะทำให้กุ้งเครย์ฟิช นั้นมีอาการหลังตาย ตัวออกสีส้มๆ เนื้อขาวขุ่น ได้เช่นกัน
ลักษณะของกุ้งเครย์ ฯ ที่เป็นโรคจากแบคทีเรียนี้ อัตราการตายของกุ้งจะช้ากว่า โรคที่เกิดจากไวรัสครับ สาเหตุเกิดจากความหมักหมมและ สกปรกของ พื้นบ่อดิน หรือ บ่อปูน และ ภาชนะที่เลี้ยง ทำให้กุ้งเครย์ฟิช เกิดอาการป่วย ซึ่งโรคจากแบคทีเรียนี้ ก็สามารถใช้วิธีในการป้องกันให้เกิดขึ้นได้ เช่นเดียวกับ โรคที่เกิดจากไวรัสครับ เพียงแต่ความรุนแรงของโรค และ อัตราการตาย อาจจะช้ากว่าเล็กน้อยครับ ( แต่ก็ตายกันรัวๆ ได้เหมือนกัน สรุปแล้ว อันตรายทั้งคู่ครับ ) อันนี้จึงเป็นคำตอบว่า ทำไมกุ้งที่เลี้ยงในระบบปิด ให้แต่อาหารสำเร็จรูป จึงเกิดโรคได้นั่นก็คือ โรคจากแบคทีเรีย ที่เกิดจากความหมักหมม ของพื้นตู้ ในการเลี้ยงเป็นหลัก

ส่วนการจำแนกว่า เป็นเชื้อแบคทีเรีย หรือ ไวรัส ชนิดใหนนั้น ต้องจำแนกด้วยวิธีการนำเนื้อเยื่อ ของกุ้งที่เป็นโรค นำไปเข้าแล็บ และนำวิธีการตรวจสอบแบบ PCR และ เทคนิคชีวโมเลกุลระดับสูง อื่นๆ เช่น hybridization,westen blot analysis เป็นต้น หรือ การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน ดูลักษณะอนุภาคของเชื้อในเนื้อเยื่อ และ เทคนิค ชีววิเคราะห์ โดยนำเชื้อจากกุ้งที่ป่วย มาฉีดเข้าในกุ้งปกติ และ ดูอาการที่เกิดขึ้นในภายหลัง สำหรับ กุ้งที่ป่วยเป็นโรคจากแบคทีเรียนั้น ถ้าทราบว่าเป็นแบคทีเรียชนิดใหน และ ความเสียหายอยู่ในระยะเริ่มต้น ก็พอจะสามารถหายาปฏิชีวนะประเภทต้านเชื้อโรค มาคลุกกับอาหารกุ้ง และ สารเคลือบอาหาร เช่น ไคโตซาน แล้วนำมาให้กุ้งกิน ยับยั้งการระบาดของโรค พร้อมเร่งทำความสะอาด สถานที่เลี้ยงได้ครับ

แต่หนทางที่ดีทีสุดคือ การป้องกันการเกิดโรค จากทั้งไวรัส และ แบคทีเรีย จะดีที่สุดครับ

ตัวอย่าง เทคนิคการทำ PCR

1. การเตรียมตัวอย่าง

สารเคมี
Lysis Solution
- 0.05 N NaOH
- 0.25% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
การบดตัวอย่าง

1. นำตัวอย่างลูกกุ้งหรือเหงือกและเนื้อเยื่อใต้เปลือกของกุ้งใหญ่ใส่ในหลอดเปล่าขนาด 1.5 ml.โดยไม่ให้จำนวน
ที่ใส่เกินขีดปริมาตร 0.1ที่ระบุไว้ข้างหลอดโดยประมาณ สำหรับลูกกุ้ง P5-P15จะใช้จำนวน 30-40 ตัว/หลอด
แช่ใน Ethyl Alcohol 70-95%

2. ใช้ Autopipette ดูด Alcohol ออกให้มากที่สุด

3. การบดตัวอย่างเติมสารสองตัว ( Lysis Solution ) คือ 0.05 N NaOH และ 0.025% SDS อย่าง
ละ 100 ul (microliter) (สารสองตัวนี้จะเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง)

4. บดกุ้งให้ละเอียดที่สุดเท่าที่จะละเอียดได้ ไม่ต้องกังวลเรื่องเวลามากนัก เพราะ NaOH และ SDS
จะเป็นตัวยับยั้งการทำงานการทำงานของเอ็นไซม์ แต่ก็ไม่ควรให้นานเกินไป

5. ต้มในน้ำเดือด 5 นาที โดยเจาะรูที่ฝาเพื่อกันระเบิด

6. รีบแช่ในน้ำแข็ง ทิ้งไว้สักพักแล้วนำหลอดขึ้นมาสะบัดเบา ๆ เพื่อให้ตะกอนที่เกาะตามข้างหลอดตกลงมาที่
ก้นหลอด โดยไม่ต้อง Centrifuge ให้ตะกอนแยกชั้นจากสารละลาย

เตรียมตัวอย่างเสร็จแล้วควรทำ PCR ไม่ควรเก็บไว้นานเกิน 1 วัน

ข้อควรระวัง

1. ขั้นตอนการบดตัวอย่างควรบดให้ละเอียดและเร็ว ถ้ายังไม่ต้มทันทีหลังจากบดควรแช่หลอดไว้ในน้ำ แข็ง
2. ต้องสวมถุงมือสะอาดในการทำทุกขั้นตอน
3. Tip ที่ใช้แล้วไม่ควรใช้ซ้ำอีก

2. การเตรียมสารละลายในการทำ PCR (cocktail)
สำหรับ 1 Reaction (total Volume = 50 ul คือ 45 ul Cocktail + 5 ul Template) 
Cocktail ul
Sterilized Distilled Water 22.0
dNTP (1 mM) 10.0
10x PCR Buffer 5.0
MgCl2 (25 mM) 3.0
Primer 1 2.5
Primer 2 2.5
Taq Polymerrase (5 unit / ul) 0.4

สำหรับ Positive Control ใช้ครั้งละ 5 ul รวมทั้งใช้น้ำกลั่น sterile ครั้งละ 5 ul สำหรับ NegativeControl

ข้อควรระวัง

1. Tip และ Tube (0.5 และ 1.5 ml.) ที่ใช้ในทุกขั้นตอนต้องผ่านการ sterilization
2. Tip ที่ใช้ดูดสารใดสารหนึ่งแล้วไม่ควรใช้ซ้ำอีก
3. การดูด Enzyme ควรใช้ Tip แตะที่ขอบบนของสารละลาย การจุ่มปลาTip ลงไปมาก จะทำให้ปริมาตร
ของ Enzyme ที่ได้ผิด

3. การทำ PCR

1. ใช้ Autopipette ดูดสารละลายใสส่วนบนที่ได้จากการเตรียม Sample ในข้อ1. จำนวน 5 ul ใส่ใน
หลอดขนาด 0.5 ml. สำหรับเครื่อง PCR ที่ใช้สำหรับหลอดขนาด 0.2 ml. อัตราส่วน cocktail ก็ลดลงตาม
สัดส่วน
2. ใส่ Cocktail จากข้อ 2. ที่เตรียมไว้หลอดละ 45 ul
3 .ผสมสารละลายด้วย vortex
4. หยด Mineral oil 2 หยด
5 Run PCR ตาม Progrme ดังนี้
90 องศาเซลเซียส 3 นาที 60 องศาเซลเซียส 30 วินาที 72 องศาเซลเซียส 30 วินาที 1 cycle
90 องศาเซลเซียส 30 วินาที 60 องศาเซลเซียส 30 วินาที 72 องศาเซลเซียส 30 วินาที 33 cycle
90 องศาเซลเซียส 30 วินาที 60 องศาเซลเซียส 30 วินาที 72 องศาเซลเซียส 5 นาที 1 cycle

4. การตรวจหา PCR Product จาก Gel Electrophoresis และการถ่ายรูป

การเตรียมสาร

Tris - borate buffer (TBE) 
10X = ( 0.89 M Tris, 0.89 M Boric acid, 0.02 M EDTA ( pH 8.0 )
= 108 g Tris, 55 g Boric acid, 40 ml. 0.5 M EDTA ( pH 8.0 )
4.1 การเตรียม gel 1.5% ( w/v) 
1. ชั่ง Agaroe gel ใส่ในบัฟเฟอร์ TBE (1X) ให้มีความเข้มข้น 1.5%
2. ต้มจนกระทั่ง Agaroe ละลายในบัฟเฟอร์เป็นเนื้อเดียวกัน
3. ทิ้งไว้ให้เย็นลงถึงประมาณ 60๐C นำไปเทลง Gel Chamber ที่มี Comb ตั้งอยู่เรียบร้อยแล้ว
4. ทิ้งไว้จน Agarose แข็งตัวจึงดึง comb ออก และเท TBE (1X) จนท่วม Gel เล็กน้อย
4.2 Gel Electrophorisis
1. ผสมสารละลาย PCR Product 15 ul กับ Loading dye 3-5 ul แล้วหยดลงใน well ของ Agarose
gel ที่เตรียมไว้ (เว้น well แรกสำหรับหยอด DNA marker)
2. ต่อขั้ว Electrode กับ Power Supply โดยให้กระแสวิ่งจากขั้วบอกภายใต้แรงเคลื่อนไฟฟ้า (Voltage)
ที่คงที่ (100 volts นานประมาณ 45 นาที)
3. เมื่อครบเวลาจึงหยุดเครื่องแล้วนำ gel ไปแช่ในสารละลาย 1ug/ml Ethidium bromide ประมาณ 10 นาที
4. ตัก gel ออกจากสารละลาย Ethidium bromide ไปล้างในน้ำกลั่นนานประมาณ 15 นาที
5. นำแผ่น gel มาดู PCR Product ด้วย UV-Source และถ่ายรูป

ข้อควรระวัง
1. แสง UV เป็นอันตรายต่อสายตาควรสวมแว่นตาป้องกันแสง UV ขณะปฏิบัติงาน
2. Ethidium bromide เป็นสารอันตรายอย่างมาก ห้ามสัมผัสโดยตรงโดยไม่ใส่ถุงมือ

การลดความเป็นพิษของสารละลาย Ethidium bromide ก่อนทิ้ง
1. เติมน้ำ 1 เท่าตัวของสารละลาย Ethidium bromide ในขณะนั้น
2. เติม 0.5 M KMn04 (ด่างทับทิม) 1 เท่าตัวของสารละลาย Ethidium bromide ที่เติมน้ำแล้วผสมให้
เข้ากันระวังอย่าให้สารละลายหกออกมา
3. เติม 2.5 M HCI 1 เท่าตัวของปริมาตรทั้งหมดที่มีอยู่ ผสมให้เข้ากัน และทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง 1 วัน
4. เติม 2.5 M NaOH อีก 1 เท่าตัว ผสมให้เข้ากันแล้วจึงเททิ้ง

เครดิต ข้อมูล

ศ.ดร.วิชัย บุญแสง คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยมหิดล

เรียบเรียง : กษิดิศ วรรณุรักษ์

เครดิตภาพประกอบ : การทดลองฉีดเชื้อ WSSV ในกุ้งสาย P.clarkii